【临床研究】具有路易体痴呆样临床表现的早老素-1基因突变家族性阿尔茨海默病一家系

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楼主 2018-11-10 01:13:48
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作者:李珺 贾树红 乔亚男 王康 顾卫红 钱端 焦劲松 金淼 


摘要  

目的

研究1个有路易体痴呆样表现的早老素-1基因突变阿尔茨海默病家系的临床表现及存在的基因突变。

方法

分析该家系中患者的临床表现及辅助检查结果,采集先证者及其女儿的血样,并选100名健康体检者设立健康对照,提取基因组DNA,采用直接测序法进行早老素-1、微管相关蛋白tau(MAPT)基因检测。

结果

该家系中有3名成员具有路易体痴呆样临床表现,先证者及其女儿的早老素-1基因第12号外显子第1 292位碱基均发生变异(C→T),导致第431位密码子编码的氨基酸由Ala变为Val。MAPT基因未发现致病突变。健康对照组未发现相似的早老素-1基因突变。

结论

该家系早老素-1基因发生A431V突变,证实在中国人群存在这一突变现象并且导致发病。该基因变异导致的家族性阿尔茨海默病也可以出现路易体痴呆样的特殊临床表现。


阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)和路易体痴呆(dementia with Lewy bodies,DLB)是引起进行性认知功能障碍最常见的两种神经退行性病。AD可分为散发性和家族性2种类型,早老素-1基因是早发性家族性阿尔茨海默病(familial Alzheimer's disease, FAD)最常见的致病基因之一[1]。DLB多呈散发。最近,我们发现1个具有DLB样临床表现的家系,提取2名家族成员外周血基因组DNA进行早老素-1基因检测,发现了早老素-1基因突变位点,经查阅文献,这一位点目前国内未有记述,且国内尚未见早老素-1基因突变的FAD家系出现DLB样表现的报道,现报道如下。


资料和方法

一、临床资料

该家系共16名成员(家系图见图1),汉族,居住在北京市,男性8名,女性8名。对该家系成员询问病史及行体格检查,按照2005年修订后的国际DLB临床诊断标准[2],Ⅱ5符合临床很可能DLB的诊断标准。Ⅰ2于50余岁时出现记忆力减退,爱捡东西回家,无动作迟缓和性格改变,已去世。Ⅱ2于50岁时出现记忆力下降,后逐渐出现行动迟缓。Ⅱ4于50余岁时出现记忆力下降、行动迟缓和幻觉,目前处于卧床状态。Ⅱ2与Ⅱ4也出现了类似DLB样的临床表现,但均拒绝体格检查和检测。

图1 具有路易体痴呆样临床表现的阿尔茨海默病患者家系图


先证者(Ⅱ5)为男性,57岁,因"记忆力下降伴性格改变4年,动作迟缓1年"于2015年1月14日住院。4年前患者家人发现患者记忆力下降,记不住刚刚说过的话,忘记明天的工作计划,无法胜任以往的工作。并出现性格改变,表现为爱发脾气及摔东西。记忆力下降逐渐加重,2年前出现出门后找不到回家的路,记不住上一顿饭吃了什么,记忆力减退时好时坏。性格改变亦逐渐加重,偶有发脾气时出现自伤和伤人行为。1年前患者出现行走缓慢,动作迟缓,无肢体震颤。半年前开始偶出现视幻觉,例如诉说看见很多人在家中走动。既往体健,大学文化程度,受教育年限16年,为国家一级建造师。体格检查:血压120/80 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),卧立位血压正常。面具脸,意识清楚,构音欠清,时间、地点定向力差,人物定向力正常,远近记忆力均差,计算力差(不能计算100-7),理解力差,四肢肌张力增高,双侧共济稳准,轮替运动欠灵活,双侧膝腱反射活跃,余神经系统体检正常。辅助检查:血常规示轻度贫血(血红蛋白119 g/L,红细胞计数3.76×1012/L),甲状腺功能检查示血清总三碘甲腺原氨酸(T3) 0.774 ng/ml(正常值0.8~2.0 ng/ml),总四碘甲腺原氨酸(T4)、游离T3、游离T4、促甲状腺激素均在正常范围,血梅毒抗体(-),维生素B12、叶酸水平正常。载脂蛋白E(ApoE)基因为ε3/3型。NOTCH3基因第2~6外显子未发现致病突变。脑电图示清醒及睡眠时各导较弥漫持续单个中波幅2~3次/s复形慢波及其活动。头颅MRI(图2)示脑萎缩,以海马及颞叶为著,颅内多发缺血灶,右侧鞍上池混杂信号灶,进一步行MRA及磁敏感检查证实右侧鞍上池异常信号为大脑中动脉迂曲扩张表现。脑计算机发射断层扫描(图3)示双侧额叶、顶叶、颞叶、枕叶血流灌注减低。经颅超声检查示双侧基底节异常高回声。MMSE评分4分,蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分3分,帕金森病综合评分量表第三部分评分19分。

图2 具有路易体痴呆样临床表现的阿尔茨海默病家系先证者头颅影像(横截位)。A~I为患者头颅MRI T2 FLAIR像,显示脑萎缩,以海马及颞叶为著,颅内多发缺血灶,右侧鞍上池混杂信号灶。J为头颅MRA像,显示鞍上池混杂信号灶为大脑中动脉M1段迂曲扩张伴局灶狭窄


图3 有路易体痴呆样临床表现的阿尔茨海默病家系先证者脑计算机发射断层扫描显像示双侧额叶、顶叶、颞叶、枕叶血流灌注减低


3为女性,31岁,为先证者女儿,既往体健,高中文化程度,受教育年限12年。无记忆力下降、性格改变、行动迟缓、幻觉等症状。MMSE评分30分,MoCA评分29分。头颅MRI未见明显异常。基底节超声示中脑黑质面积稍增大(右0.28 cm,左0.31 cm),余正常。


二、基因检测对象

经家属同意并签署知情同意书后,采集Ⅱ5及Ⅲ3的血样,放置于枸橼酸钠抗凝管中,对Ⅱ5进行微管相关蛋白tau(microtubule-associated protein tau, MAPT)、早老素-1基因检测。


与家系成员相匹配,设对照组100名,其中男48名,女52名,平均年龄52.1岁,全部为无痴呆的健康体检志愿者。对Ⅲ3及对照组进行早老素-1基因突变分析。本试验得到我院伦理委员会的批准,并且所有受试者均书面签署了知情同意书。


三、基因检测方法

1.实验所用试剂:

BigDye[应用生物系统公司(Applied Biosystems),美国];Axyprep DNA Gel EXraction kit[爱思进生物技术(杭州)有限公司]。引物由生工生物工程(北京)股份有限公司合成,使用primer3在线设计。


2.PCR扩增:

反应体系为20 μl,含1.0 μl DNA模板,2×GCI缓冲液10 μl [200 mmol/L(NH4)2SO4、20 mmol/L MgCL2],上下游引物(第12号外显子引物序列:上游5'-TCCAGATTGAA-TGAACGTCTGT-3',下游5'-AGACTT-GGAAGGAAGCTGCA-3')各0.4 μl,dNTP 0.5 μl,Taq酶0.4 μl,ddH2O 7.3 μl。PCR扩增条件为:95 ℃预变性3 min,然后95 ℃30 s、58 ℃40 s、72 ℃ 1 min/kb循环32次,末次循环后均72 ℃最后延伸10 min。


3.PCR产物电泳和纯化:

制备1.5%琼脂糖凝胶,在酶标板各孔加入1 μl溴酚蓝,按样品顺序各取出来2 μl和溴酚蓝混合均匀,加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压150~200 V。电泳完毕后,取出凝胶使用凝胶成像系统拍照保存。使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。


4.测序:

测序反应体系10 μl,包括纯化后的PCR产物3 μl、水4 μl、测序引物1 μl、BigDye 2 μl。96 ℃预变性2min,然后96 ℃10 s、50 ℃10 s、60 ℃ 3 min 10


s循环30次。测序产物经纯化后上测序仪测序。使用DNASTAR.Lasergene.v7.1软件进行数据的拼接得到序列结果。


结果

5与Ⅲ3早老素-1基因第12号外显子第1 292位碱基发生变异(C→T),导致第431位密码子编码的氨基酸由Ala变为Val(图4)。健康对照组未发现相似的早老素-1基因突变。Ⅱ5未发现MAPT基因致病突变。

图4 有路易体痴呆样临床表现的阿尔茨海默病家系先证者早老素-1基因检查结果:第12号外显子第192位碱基发生C→T变异(箭头及标黑处)


讨论

早老素-1基因位于14q24.2,产物为3.1 kb[3]。目前国外报道的早老素-1基因突变有接近200种[4],国内有早老素-1基因第3、4、6、11号外显子突变的家系报道[5,6,7,8,9]。在本研究的家系中,2例患者均发生早老素-1基因第12号外显子431密码子A→V突变,目前国内尚未见相同位点突变的报道,国外有过1例报道,为Matsushita等[10]于2002年在1个早发型AD家系中发现,而在其研究家系内的健康对照未发现该变异位点,从而证明发生在此处的突变为病理性突变。在人类基因突变数据库(human gene mutation database, HGMD)中有该错义突变记录,并提示该错义突变很可能与AD疾病发生相关。因此,本研究的家系最终诊断为早老素-1基因12号外显子突变导致的FAD。


据2005年MeKeith等[2]提出的修订后的国际DLB临床诊断标准,先证者Ⅱ5符合:(1)DLB诊断的必备症状:进行性认知功能下降;(2)3个核心症状:波动性认知障碍、帕金森综合征、反复发作的视幻觉;(3)影像学排除脑血管性疾病。因此,先证者虽最终诊断为AD,却具有DLB样的临床表现。家系中的其他成员(Ⅱ2、Ⅱ4)也有认知功能下降、幻觉和运动迟缓症状,同样具有DLB样的临床表现。家系中的Ⅲ3虽然没有DLB的临床表现,但检测DNA同样存在早老素-1基因突变。


早老素-1基因是FAD的一种致病基因,它通过参与notch、wnt信息途径,影响淀粉样前体蛋白(APP)分泌酶和tau蛋白的异常磷酸化及凋亡,借此影响AD相关蛋白的降解调节,从而在AD发病中起重要作用[3]。本研究中的先证者并未出现典型AD样表现,而是出现了DLB样表现。国内目前尚无早老素-1突变的FAD家系出现DLB样临床表现的报道,但近年来多项国外研究发现,早老素-1突变相关FAD家系可出现DLB的临床表现[11,12]。并有多项研究[12,13,14,15]通过尸检病理证实在早老素-1基因突变患者的黑质及皮质广泛区域除存在神经元丢失、棉絮样斑、皮质脊髓束变性、淀粉样脑血管病等AD病理表现外,还存在广泛路易体形成。早老素-1基因突变出现路易体沉积病理改变的比例要远高于散发型AD和早老素-2基因突变相关的FAD[14]


早老素-1基因突变为何会出现路易体形成的病理改变?DLB是以路易体为病理特征的神经变性疾病,α-突触核蛋白(α-synuclein)为路易体结构的主要成分。研究发现,早老素-1与α-突触核蛋白有许多一致的功能,包括早期分泌途径、囊泡形成和传递、SNARE复合体形成和突触囊泡调节,这种功能的重叠提示早老素-1与α-突触核蛋白分子能够互相影响,当早老素-1功能发生异常,会使早老素-1与α-突触核蛋白分子之间的关系调节出现异常,从而导致α-突触核蛋白的异常聚集[15]。Winslow等[15]应用免疫电镜观察到早老素-1与α-突触核蛋白在突触前囊泡、线粒体表面和细胞膜上紧密相联,并通过荧光寿命成像方法证实了上述结论,他们假设:(1)通过早老素-1与α-突触核蛋白之间的相互作用,α-突触核蛋白被固定于细胞膜间隔内,降低了α-突触核蛋白的降解;(2)突变的早老素-1与α-突触核蛋白之间的直接强固联结抑制了α-突触核蛋白有效释放到蛋白酶体、自噬体和α-突触核蛋白的胞吐作用。上述临床试验与假设为早老素-1与α-突触核蛋白分子之间相互关系提供了证据,对早老素-1基因突变的AD患者出现DLB样临床表现的机制作出了阐述。


在先前的早老素-1基因A431V突变报道中的患者没有出现DLB样表现[10],但当时患者处于轻度认知功能障碍期,当发展至痴呆期时未对患者症状进行详细描述,故患者发病后期是否出现DLB样表现尚不能明确。


我们首次在国内报道了早老素-1变异的FAD家系出现DLB样临床表现,证实了该疾病可以有类似DLB样表现的特殊临床表型,使我们对早老素-1变异的FAD的临床表现异质性有更深入的认识,并提示对家族性DLB,需要考虑到早老素-1基因突变的可能。


利益冲突 无


参考文献略





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